Erasmus MC : Anieta Sieuwerts

5 december 2007
Promotor: Prof. dr. J.G.M. Klijn
Co-promotor: Dr. J.A. Foekens

Het eerste doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek was inzicht te krijgen in de wisselwerking tussen borsttumorcellen en de cellen in het omringende stroma. Een tweede doel was om dit idee van een multitype cellulaire tumor, waarin naast epitheliale tumorcellen ook tumorgeassocieerde fibroblasten en diverse andere typen cellen een actieve rol spelen, te integreren in onze zoektocht naar nieuwe prognostische en predicatieve markers. Ten slotte was er het doel om het concept van biomarkers in een groter geheel te plaatsen door naar de biologische paden te kijken waar ze onderdeel van zijn, in plaats van naar de individuele biomarkers. Meer specifiek: de onderwerpen die in dit proefschrift beschreven werden zijn: 1) studies naar de wisselwerking tussen verschillende biologische systemen, 2) studies met betrekking tot prognose, en 3) studies met betrekking tot het voorspellen of een patiënt wel of niet zal reageren op tamoxifen therapie.<br><br>

Algemene inleiding
Om de lezer meer bekend te maken met het basisprincipe van borstkanker en de histologische en moleculaire technieken die worden gebruikt om borstkanker te bestuderen, is er een algemene inleiding opgenomen in hoofdstuk 1. Samengevat is in dit hoofdstuk uitgelegd dat borstkanker de bij vrouwen meest voorkomende soort kanker is, verantwoordelijk voor 30% van alle vrouwelijke kankerpatiënten. In de westerse wereld is het zelfs de belangrijkste doodsoorzaak voor vrouwen in de leeftijd van 35 tot 55 jaar. Vroege opsporing en nieuwe behandelingsmethodes, deels gebaseerd op nieuwe inzichten, hebben tot een verbetering in de behandeling en een daling van sterfte ten gevolge van borstkanker geleid. Maar het probleem met borstkanker is dat het een heterogene ziekte is die meerdere vormen omvat, ieder met een eigen specifiek ziekteverloop. Bovendien is er nu groeiend inzicht dat het weefsel dat de tumorcellen omgeeft (het stroma), signalen kan afgeven die mogelijk verantwoordelijk zijn voor de genetische veranderingen die voorafgaan aan het ontstaan van een tumor, tumorgroei en uitzaaiingen bevorderen, sturing geven aan de manier waarop een tumor op therapie reageert en het uiteindelijke ziekteverloop bepalen. Daarom moet kanker worden gezien als een multitype cellulair proces waarin de epitheliale tumorcellen zelf, de tumorgeassocieerde fibroblasten en diverse andere cellen die zich in een tumor in de directe omgeving van de epitheliale tumorcellen bevinden, allen een actieve rol spelen. Om de dokter te helpen met de behandeling van deze heterogene en multitype cellulaire ziekte, wordt kanker gekarakteriseerd door histologie, stagering, gradering en expressie van biomarkers. Biomarkers zijn biologische stoffen die gewoonlijk in kleine hoeveelheid in tumorweefsel of lichaamsvocht aanwezig zijn en omvatten een grote verscheidenheid aan moleculen zoals transcriptie factoren, celreceptoren en uitgescheiden eiwitten. Deze biomarkers worden tijdens de begeleiding van de borstkankerpatiënt om de volgende redenen gemeten: 1) voor vroege opsporing, 2) ter begeleiding van patiënten met uitgezaaide ziekte, 3) om het ziekteverloop te voorspellen, 4) om te voorspellen waar de uitzaaiing van de tumor zal plaatsvinden, en 5) om te voorspellen of de patiënt zal reageren op een therapie. Het is voor dit proefschrift belangrijk het verschil tussen een prognostische en een predicatieve biomarker te begrijpen: een prognostische biomarker voorspelt de kans op terugkeer van de ziekte of op tumorgroei, onafhankelijk van toekomstige behandelingseffecten. Een predicatieve biomarker voorspelt of de patient zal reageren op een specifieke behandeling. Elke verandering in het verloop van de ziekte moet worden weerspiegeld door een verandering in de waarden van de biomarker. Verrassend genoeg in deze 'high-throughput' eeuw, zijn de enige algemeen erkende biomarkers voor borstkanker momenteel de in bloedserum aanwezige antistoffen CA 15-3, CA 125, CA 27-29 en CEA, en de in tumorweefsel gemeten receptoren voor oestrogeen en progesteron, markers die de hoeveelheid DNA en/of celdelingsnelheid meten, het oncogen ERBB2, het tumorsuppressor gen p53, de eiwitafbrekende protease uPA en zijn remmer PAI-1, en twee markers om de gevoeligheid voor erfelijke borstkanker te meten (BRCA1 en BRCA2). Kortom, er is een dringende vraag naar nieuwe biomarkers.<br><br>

Methodes
De technieken om naar nieuwe biomarkers te zoeken, hun bruikbaarheid te testen en om ze een biologische functie te geven, hebben een grote vooruitgang gemaakt in deze gecomputeriseerde eeuw van 'proteomics' om eiwitten te bestuderen en 'genomics' om genen te bestuderen. Kwantitatieve real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (real-time RT-PCR of qRT-PCR) is een van de methodes die het mogelijk maakt genproducten te kwantificeren als zij zich ophopen in de tijd (''realtime'') tijdens het PCR amplificatieproces. Wetenschappelijke onderzoekers, die voor nieuwe diagnostiek- en therapiemethodes hun hoop hebben gevestigd op moleculaire markers, moeten kunnen beschikken over materialen van een grote verscheidenheid aan patiënten. Hiertoe zijn biobanken met opgeslagen weefsels, lichaamsvochten en gerelateerde producten zoals DNA, RNA en eiwitextracten uiterst belangrijk. Een voorbeeld van zo'n goed gekarakteriseerde bank met vers ingevroren borstkankerweefsel is opgezet door de afdeling Medische Oncologie aan het Erasmus Medisch Centrum te Rotterdam in Nederland. Deze bank bevat momenteel meer dan 14,000 monsters van borstkankerweefsel die sinds 1978 zijn verzameld, en direct na de operatie opgeslagen zijn in vloeibare stikstof. Van 5,500 patiënten is er een geautomatiseerd bestand met bijgewerkte klinische gegevens beschikbaar. Bovendien is er informatie betreffende de hoge kwaliteitsextracten van DNA uit 3,000 weefsels, van RNA uit 2,000 weefsels, en van eiwit uit 10,000 weefsels opgeslagen in geautomatiseerde gegevensbestanden. De klinische RNA monsters zijn een zeer belangrijke bron geweest voor de studies om nieuwe markers te ontdekken zoals deze in dit proefschrift worden beschreven.<br><br>

Resultaten en conclusies
Om de doelstellingen te bereiken die voor dit proefschrift waren opgesteld, is in hoofdstuk 2 de rol van normale en met tumorweefsel geassocieerde fibroblasten onderzocht in relatie tot expressie van componenten van het plasminogeenactivator (PA) systeem en het 'insuline-like-groeifactor' (IGF) systeem, voor en nadat deze fibroblasten aan verschillende groeifactoren voor fibroblasten (FGFs) waren blootgesteld. De in vitro data die in dit hoofdstuk gegeven worden, suggereerden dat van de bestudeerde FGFs (FGF-1, -2, -4, 5, en -7), FGF-2 het meest interessante doelwit is voor therapeutische strategieën die gericht zijn op het verminderen van de bijdrage van de stromale fibroblasten in het proces van de -door het PA-systeem aangestuurde- eiwitafbraak. Door de toenemende vergrijzing van de bevolking is met name de leeftijdsgebonden toename in de borstkankerincidentie zorgwerkend. In hoofdstuk 3 is de functie van normale en met tumorweefsel geassocieerde fibroblasten in relatie tot dit belangrijke onderwerp onderzocht. Hiertoe hebben we bekeken of fibroblasten, die we in het laboratorium in kweek hebben laten verouderen, veranderingen gaven in de concentraties van bestanddelen van het PA systeem en van groeifactoren waarvan bekend is dat ze het PA-systeem beinvloeden. Onze resultaten lieten zien dat veroudering gecombineerd met verlies van telomeerlengte in alle fibroblastkweken gepaard ging met een toename in de productie van PAI-1 en FGF-1 mRNA, in een subset van de fibroblastkweken met een toename van uPA en een afname van IGF-1 mRNA, en alleen in fibroblasten afkomstig uit tumorweefsel met een toename in de eiwitproductie van matrixmetalloproteinases-2 (MMP-2). Derhalve kunnen de leeftijdsafhankelijke veranderingen van biomarkers in stromale borstfibroblasten bijdragen aan borstkankerprogressie. In hoofdstuk 4 is het belang van het multitype cellulaire concept in een klinische setting ondervonden. Hier hebben we in patiënten, die met tamoxifen waren behandeld voor uitgezaaide borstkanker, gekeken naar de predicatieve waarde van de disintegrine en metalloproteinases ADAM-9, ADAM-10, ADAM-11, en ADAM-12, en de matrixmetalloproteinases MMP-2 en MMP-9. De analyses lieten zien dat met name voor primaire tumoren die voor een groot deel uit stromale bestanddelen bestaan, het bepalen van ADAM-9 en ADAM-10 mRNA concentraties bruikbaar zou kunnen zijn om patiënten te identificeren die een grotere kans hebben wel of niet te reageren op een behandeling met tamoxifen voor teruggekeerde borstkanker. Een van de toepassingen van qRT-PCR is het in een groter patiëntenbestand valideren van in microarray-experimenten gevonden vermoedelijke biomarkers. Een voorbeeld van zo'n biomarker is cycline E2 (CCNE2), een gen dat voorkwam in twee onafhankelijk tot stand gekomen prognostische genprofielen. In hoofdstuk 5 hebben we beschreven hoe we met deze kwantitatieve methode de prognostische waarde van cycline E hebben geëvalueerd in een groot bestand van 635 borstkanker patiënten met negatieve lymfklieren (LNN) die geen systemische aanvullende behandeling hadden gehad. De studie liet zien dat zowel CCNE1 als CCNE2 kwalificeerden als onafhankelijke prognostische markers voor LNN borstkankerpatiënten, en dat CCNE1 extra informatie kan geven voor specifieke subgroepen patiënten met stroma-rijke primaire tumoren. Een andere controlestudie, beschreven in hoofdstuk 6, betrof de HOXB13-IL17BR ratio, een ratio die al eerder was geïdentificeerd als een maat op grond waarvan het ziekteverloop kon worden voorspeld van borstkankerpatiënten die adjuvant behandeld waren met tamoxifen. Hier hebben wij aangetoond dat een hoge HOXB13-IL17BR ratio, bovenop de associatie met het falen van tamoxifen therapie voor uitgezaaide ziekte, ook geassocieerd is met de intrinsieke agressiviteit van een tumor. Nadat wij twee alternatief gesplitste varianten van 'tissue-inhibitor of metalloproteinases-1' (TIMP1) mRNA hadden ontdekt en deze verder hadden geïdentificeerd in kankercellijnen en darmkankerweefsel ( hoofdstuk 7), hebben wij de prognostische waarde van deze varianten verder onderzocht in 1301 primaire borstkankermonsters ( hoofdstuk 8). Terwijl hoge concentraties TIMP-1 eiwit worden geassocieerd met een slechte prognose, vonden wij dat in de primaire borstkanker gemeten hoge concentraties TIMP1-v1+2 mRNA zijn geassocieerd met een goede prognose. Een dergelijke differentiële associatie, mogelijk een aanwijzing voor de aanwezigheid van posttranscriptionele mechanismes, zou ons kunnen helpen de rol van TIMP-1 ten aanzien van borstkankerprogressie beter te begrijpen. Zoals besproken in hoofdstuk 5, hebben gepubliceerde prognostische genprofielen maar een paar gemeenschappelijke genen. In hoofdstuk 9 hebben we aangetoond dat deze uiteenlopende genensets, die patiënten voor eenzelfde klinisch eindpunt classificeren, deel uitmaken van overeenkomstige biologische processen, en dat het daarom beter is om een voorspelling te geven op grond van profielen die zulke biologische paden beschrijven. Zulke profielen, die tumoren karakteriseren op grond van biologisch actieve paden, zouden cruciale informatie kunnen verschaffen die nodig is om geschikte medicijncombinaties te ontwikkelen.<br><br>

Algemene discussie en toekomstvooruitzichten
In hoofdstuk 10 tenslotte, zijn drie onderdelen verder uitgewerkt die gemeenschappelijk uit de beschreven studies naar voren kwamen. Dit resulteerde in de volgende conclusies en aanbevelingen: Ten eerste, enkel en alleen gebaseerd op de samenstelling van de tumor (de verhouding tussen epitheliale tumorcellen en stromale cellen), zijn we in staat geweest een grof onderscheid te maken tussen histologische fenotypen en op microarray gebaseerde genotypen met verschillende prognostische eigenschappen. Bovendien onderstreepten deze waarnemingen het belang van de opvatting dat kanker gezien moet worden als een proces waarin meerdere celtypen, zoals de epitheliale tumorcellen zelf, de tumorgeassocieerde fibroblasten en diverse andere cellen die zich in een tumoromgeving bevinden, actieve deelnemers zijn. Ten tweede bleek uit werk van onze groep dat een concentratie van genen op de lange arm van chromosoom 17q12-25, aanvullend op de associatie van genen in dit gebied met het risico op borstkanker in het algemeen, geassocieerd is met gevoeligheid voor tamoxifen. Met name de genen in dit chromosomale gebied die een verhoogde expressie laten zien in tamoxifen ongevoelige tumoren, werden als veelbelovende kandidaten voor doelgerichte therapie aanbevolen.
Ten slotte is in dit proefschrift aangetoond dat qRT-PCR een gevoelige, snelle, kwantitatieve, kostenbesparende methode is, die uitermate geschikt is om mRNAconcentraties te meten van genen die verschillend tot expressie komen in de primaire tumoren van borstkankerpatiënten met verschillende prognostische en predicatieve kenmerken. Zelfs wanneer er geen antilichamen beschikbaar zijn om eiwit aan te tonen, is men met qRT-PCR in ieder geval in staat de mRNA concentraties kwantitatief te meten, vandaag de dag ook in formaline-gefixeerd weefsel dat in paraffine is ingebed. Er bestaat daarom geen twijfel dat het meten van een enkel gen, of meerdere genen in een multiplex reactie, met behulp van qRT-PCR een belangrijke kwantitatieve methode zal blijven om snel te screenen op diagnostische en therapeutische markers.