Michiel Strijbos
Quantification of circulating endothelial cells as surrogate marker for vascular damage.
27 november 2009
Promotor: Prof. dr. J.A. Foekens
Co-promotoren: Dr. S. Sleijfer en Dr. J.W. Gratama
Vasculaire biomarkers in de oncologie
De vasculaire intima bestaat uit ca. 1.2 * 1012 endotheelcellen. Het endotheel vormt niet uitsluitend een barrière tussen het bloed en de organen, maar is een dynamische structuur met een groot aantal functies. Zo zijn endotheelcellen van groot belang voor de regulatie van de vasomotor tonus, voor hemostase, voor vocht- en elektrolytentransport. Zij spelen tevens een grote rol in de regulatie van inflammatie en angiogenese. De kwantificatie van specifieke endotheliale eigenschappen, zoals de mate van activatie, dysfunctie, proliferatie, of de mate van vaatschade kan van groot klinisch belang zijn.
Zeker in de oncologie zou de kwantificering van vaatschade relevante informatie kunnen opleveren. De structuur en fysiologie van tumorvasculatuur verschilt sterk van de normale vasculatuur. Ze zijn fragiel, hebben een verhoogde permeabiliteit voor een groot aantal moleculen, en zijn verminderd gevoelig aan vassopressoren en dilatatoren. Ook de normale vasculatuur van kankerpatiënten raakt gemakkelijk aangetast, wanneer de door de tumor gesecreteerde matrixmetalloproteinasen het vasculaire basale membraan degraderen. Dit is noodzakelijk voor de extravasatie en metastasering van maligne cellen. Als de mate van endotheelschade effectief zou correleren met de mate van metastasering, zou een surrogaatmerker voor vaatschade een prognostische waarde kunnen hebben.
Naast een mogelijke rol als prognostische marker, zou een surrogaatmerker voor vaatschade van belang kunnen zijn in de vroegtijdige identificatie van patiënten. Bij patiënten met een goede respons op antivasculaire therapie met bijvoorbeeld monoklonale antistoffen of receptor tyrosine kinaseremmers, zou een duidelijke toename van vaatschade kunnen duiden op een gunstig effect van de behandeling. Bij patiënten zonder duidelijke respons kan de arts beslissen de behandeling te stoppen en zo de patiënt onnodige toxiciteit besparen.
Echter, het implementeren van CEC als routinebepaling in een klinische setting wordt vooralsnog gehinderd door ten eerste het zeer lage aantal CEC in de circulatie, en ten tweede de onenigheid over het juiste immunofenotype en de meest geschikte detectietechniek. Dit proefschrift gaat over het detecteren van CEC, de vooren nadelen van de huidige beschikbare technieken en over de mogelijke toepassingen van CEC als surrogaatmerker voor vaatschade.
Hoofdstuk 1 geeft een algemene introductie en beschrijft de doelstellingen van dit proefschrift.
In hoofdstuk 2 worden diverse CEC detectietechnieken en hun voor- en nadelen besproken. Er wordt ook een overzicht gegeven van de mogelijke toepassingen van CEC als surrogaatmerker in de oncologie.
In hoofdstuk 3 valideren wij een frequent gebruikt detectie assay dat gebaseerd is op flow cytometrie. Met dit assay worden klinisch relevante resultaten beschreven. Echter, het aantal CEC dat gedetecteerd wordt met dit assay staat mee staat in sterk contrast tot eerdere studies. Op basis van de resultaten van deze studie hebben wij besloten om alle vervolgstudies uit te voeren met het CellSearch™ assay, ontwikkeld door Immunicon (tegenwoordig Veridex, Raritan, NJ).
Dit assay gebruikt immunomagnetische verrijking door middel van een CD146-gebonden monoklonale antistof, gevolgd door image cytometrie. De geïsoleerde CD146 positieve cellen worden gekleurd met fluorochroom gelabelde monoklonale antistoffen tegen de endotheliale merker CD105 en de leukocytenmerker CD45, en met de kernkleuring DAPI. CEC worden gedefinieerd als intacte cellen, minimaal 4 μm in diameter, met een DAPI+, CD146+, CD105+, CD45- immunofenotype. In een studie met 40 gezonde donoren vonden wij met dit assay 0-20 CEC/mL, wat vergelijkbaar is met andere gevalideerde assays. Ook de eerdere gerapporteerde toenames van CEC aantallen bij patiënten met gemetastaseerde kanker en met sikkelcel anemie konden wij reproduceren met het CellSearch™ assay.
In hoofdstuk 4 wordt bestudeerd wat het effect is van leeftijd en geslacht op het aantal CEC in het bloed bij gezonde vrijwilligers en bij patiënten met gemetastaseerde kanker. Hiernaast wordt ook onderzocht of er een correlatie is tussen het aantal CEC en plasmaconcentraties van diverse endotheliale proteïnen.
In hoofdstuk 5 wordt onderzocht of de CEC gedetecteerd met het CellSearch™ van het vaatbed of van beenmerg afkomstig zijn. Wij beschrijven hoe door kunstmatig vaatschade op te wekken door bloedvatcannulatie, de vasculaire oorsprong van CEC gedetecteerd met het CellSearch™ wordt bevestigd.
In hoofdstuk 6 bekijken we in het bloed van gezonde donoren, kankerpatiënten en in navelstrengbloed of een semikwantitatieve PCR voor de endotheel gerelateerde proteïnen CD31, CD144, CD146 en vWF een sneller en goedkoper alternatief zou kunnen zijn voor het kwantificeren van vaatschade. De hoofdstukken 7, 8, en 9 beschrijven of CEC ons al dan niet informeren over de aanwezigheid en ernst van vaatschade bij verschillende ziektes.
In hoofdstuk 7 wordt de correlatie bestudeerd tussen CEC en een groot aantal traditionele en nieuwe serum- en plasmamerkers bij patiënten met sikkelcel anemie. Ook werd er gezocht naar een relatie tussen het aantal CEC en het aantal aangetaste organen bij deze patiënten.
Hoofdstuk 8 beschrijft een gelijkaardig onderzoek bij preeclampsie.
In hoofdstuk 9 wordt bij patiënten met hormoonrefractaire prostaatkanker onderzocht of het aantal ofwel de verandering in CEC, het aantal circulerende tumorcellen en serumconcentraties van de angiogene proteïnen Tissue Factor en Endotheline 1 van voorspellende waarde zijn voor een respons op behandeling met docetaxel.
Hoofdstuk 10 geeft een overzicht van hoe de resultaten van dit proefschrift onderzoekers en artsen in de toekomst mogelijk verder kunnen helpen met het bestuderen van vaatschade.