Erasmus MC : Nadine Pouw

23 juni 2010
Promotor: Prof. dr. J. Verweij
Co-promotor: Dr. R. Debets

Klinische behandeling van gemetastaseerd melanoom met witte bloedlichamen, de zogenaamde T lymfocyten, die de tumour herkennen (ook wel: adoptieve T cel therapie) is succesvoller gebleken dan chemotherapie of bestraling. De introductie van genen coderend voor een tumourspecifieke T cel receptor (TCR) in patiënt T cellen, en het klinische gebruik van deze T cellen (TCR gen therapie), is ontwikkeld als strategie om het succes en de toepasbaarheid van adoptieve T cel therapie te vergroten. Het doel van het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven wordt is om de meest optimale laboratorium-omstandigheden te bepalen voor het creëren van TCR-gemodificeerde T cellen die tumour cellen goed herkennen en niet volledig uitgerijpt en daardoor waarschijnlijk uitgeput zijn voordat ze klinisch gebruikt zouden worden.

Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de ontwikkeling en huidige status van TCR gen therapie, en omvat de volgende 4 onderdelen. Ten eerste word een samenvatting gegeven van de huidige literatuur over TCR gen therapie ter behandeling van solide tumouren. Ten tweede wordt een aantal barrières ten aanzien van het klinisch succes van TCR gen therapie beschreven, waaronder toxiciteit, suboptimale functionele T cel aviditeit en verminderde overleving van T cellen na infusie. Daarnaast worden ook mogelijke oplossingen voor deze problemen besproken. Ten derde worden verschillende methoden voor gen transfer, zowel viraal als niet-viraal, alsook verschillende protocollen voor retrovirale gen transfer gepresenteerd. Tenslotte wordt het gebruik van zogenaamde “common- g” cytokinen in de ex vivo kweek van (TCR-gemodificeerde) T cellen besproken, waarbij de nadruk ligt op mogelijkheden van dergelijke cytokinen in antitumour therapie.

In hoofdstuk 2 hebben we een snel, effectief en flexibel protocol opgezet om TCR a b genen te introduceren in primaire muis T cellen, welke is gebaseerd op transiënte produktie van retrovirussen. We hebben dit gedaan door retrovirussen met verschillende retrovirale envelop eiwitten te vergelijken, waarbij de retrovirussen gegenereerd werden door verschillende combinaties van virus producerende cellen. Onze resultaten laten zien dat retrovirussen met de zogenaamde MLV-A en MLV-E envelop eiwitten leiden tot de hoogste transductie efficiëntie. Hiernaast blijkt de dichtheid van T cellen tijdens transductie omgekeerd evenredig te zijn met de transductie efficiëntie. Verdere optimalisatie van het transductie protocol, wat betreft de concentratie en duur van Concanavalin A-stimulatie van T cellen voorafgaand aan gen transfer; rIL-2 concentratie; gebruik van Retronectine; and het aantal retrovirale infecties, resulteerde in transductie efficienties van > 90% voor het fluorescerende reporter transgen GFP. Hetzelfde protocol leidde tot een transductie efficiëntie van ongeveer 70% voor een humaan TCR transgen, waarvoor het gebruik van muis TCR-C domeinen noodzakelijk  bleek (i.e. TCR murinizatie) om functionele expressie in muis T cellen mogelijk te maken.

In hoofdstuk 3 hebben we T cel activatie met ofwel een lectine ofwel verschillende vormen van anti-CD3/CD28 antistoffen uitgevoerd, omdat literatuur laat zien dat de manier van T cel activatie voorafgaand aan gen transfer de transductie efficiëntie beïnvloedt. Om meer in detail te onderzoeken welke laboratorium-omstandigheden resulteren in optimale T cellen (zowel qua oppervlakte-merkers als T cel funkties), hebben we T cel activatie methoden gecombineerd met behandeling van TCR-gemodificeerde T cellen met ofwel IL-2 ofwel een combinatie van IL-15 en IL-21 (de laatste twee cytokinen zijn in meer detail bestudeerd in hoofdstukken 4 en 5). We zagen dat het lectine Concanavalin A, en in mindere mate anti-CD3/CD28 antistoffen in oplossing, resulteerde in functionele expressie van TCR a b transgenen op het celoppervlak, en verhoogde fracties van zeer jonge, zogenaamde naïeve T cellen. T cel functionaliteit en beperkte T cel differentiatie waren het duidelijkst wanneer T cellen werden behandeld met een combinatie van IL-15 en IL-21, in plaats van IL-2. Daarentegen zorgen anti-CD3/CD28 antistoffen welke gekoppeld waren aan bolletjes weliswaar voor verhoogde TCR expressie, maar ook voor een sterke T cel differentiatie en non-specifieke T cel reactiviteit (welke niet het geval was bij gebruik van lectine of antistoffen in oplossing).

In hoofdstuk 4 hebben we geprobeerd om de mechanismen verantwoordelijk voor de effecten van IL-15 en/of IL-21 op T cel differentiatie en activatie te achterhalen. Het was eerder aangetoond dat IL-21, en in mindere mate IL-15, het ‘ouder’ worden van naïeve T cellen in effector T cellen (de eerder genoemde T cel differentiatie) onderdrukt. De rationale achter deze en andere studies naar de effecten van cytokinen op T cel differentiatie is te vinden in de directe relatie tussen klinische antitumour effectiviteit en T cel persistentie, waarbij de T cel persistentie zelf weer gerelateerd is aan de mate van T cel differentiatie. T cellen gekweekt in aanwezigheid van verschillende cytokinen, alsmede de verschillende T cel subsets, werden geanalyseerd wat betreft proliferatie, expansie, celdood, cytokine receptor expressie en gen expressie profiel. We hebben laten zien dat kortdurende kweek van T cellen met IL-21, en in mindere mate IL-21 en IL-15, resulteert in een significante verrijking van naïeve T cellen, iets dat samengaat met een specifieke expressie van genen betrokken bij T cel differentiatie. Hoewel IL-21 zowel de proliferatie als de celdood van naïeve T cellen verminderde, suggereert onze data dat een veranderde expressie van bepaalde oppervlakte-merkers (kenmerkend voor naïeve T cellen) het meest bijdraagt aan de waargenomen verrijking van naïeve T cellen. IL-21 induceerde een verlaging van de expressie van IL-2 receptorketens en anti-apoptotische Bcl moleculen, hetgeen voorkòmen kan worden door IL-15 en kan leiden tot de waargenomen toename in totale T cel proliferatie in aanwezigheid van zowel IL-21 als IL-15. Een interessante bevinding was dat de combinatie van IL-21 en IL-15 resulteert in een genexpressie profiel dat kenmerkend is voor CD8-positieve effector T cellen.

In hoofdstuk 5 hebben we voortgebouwd op onze bevindingen uit hoofdstuk 4, door het gebruik van “common- g” cytokinen in de setting van TCR-gemodificeerde T cellen te onderzoeken. We hebben laten zien dat de combinatie van IL-15 en IL-21, en in mindere mate IL-21, T cellen beter in staat stelt tumourcellen te doden, hetgeen gerelateerd is aan expressie van cytotoxische moleculen zoals granzymes A en B, en perforine 1. Daarnaast zorgt een combinatie van IL-15 en IL-21 voor een synergistische toename in de hoeveelheid uitgescheiden  IFN g, en een versnelde uitscheiding van IFN g, door gedifferentieerde effector memory T cellen. Wanneer de data uit hoofdstuk 4 en 5 gecombineerd worden, veronderstellen we dat uitgaande van een heterogene T cel populatie, IL-21 resulteert in de-differentiatie van de effector memory T cellen in naïeve T cellen, terwijl de combinatie van IL-15 en IL-21 resulteert in een sterk T cel effector profiel in de overblijvende gedifferentieerde T cellen.

In hoofdstuk 6 hebben we de bevindingen van hoofdstukken 2 tot en met 5 in een bredere context van TCR gen therapie geplaatst. Nadruk is hierbij gelegd op gen transfer methoden, inclusief verschillende T cel activatie stimuli, en het gebruik van “common- g” cytokinen in adoptieve T cel therapie. Strategieën om de huidige barrières van TCR gen therapie, inclusief de besproken strategieën in hoofdstukken 2 tot en met 5, worden bediscussieerd en gecombineerd tot een voorstel voor een toekomstige klinische TCR gen therapie studie.

Naar mijn mening zij we erin geslaagd om factoren te bepalen die van belang zijn voor efficiënte TCR gen transfer en expansie van primaire T lymfocyten met een hoge transgene TCR expressie, een jong fenotype (een zogenaamd “central memory” fenotype) en potente anti-tumour functies in het laboratorium (” in vitro”). De door ons bepaalde factoren zijn niet de enige factoren die succesvolle toepassing van TCR gen therapie positief beïnvloeden, en toekomstige experimenten zullen andere belangrijke factoren dienen te identificeren, alsook de in vivo functionaliteit (funktionaliteit in proefdieren) dienen te bevestigen van T cellen gegenereerd onder condities zoals beschreven in het huidige proefschrift. Toekomstige klinische studies moeten, naar mijn mening, nadruk leggen op de volgende punten: keuze van T cel target antigen; moleculaire vorm van de receptor; combinatie met andere vormen van therapie; monitoren van antitumour effecten en bijwerkingen; en uiteindelijk de inclusie van andere kankersoorten. Op korte termijn zou een TCR gen therapie studie ter behandeling van gemetastaseerd melanoom als volgt kunnen worden uitgewerkt. Een TCR specifiek voor MAGE antigenen zou kunnen worden gebruikt, waarbij de receptor moleculair zo moet worden aangepast dat preferentiële paring tussen de geïntroduceerde TCR a en – b ketens wordt verzekerd, en de receptor dusdanig in een retrovirale vector moeten worden geplaatst dat beide TCR ketens door een 2A peptide sequentie gescheiden worden. T cellen van de patiënten moeten bij voorkeur worden geactiveerd met anti-CD3/CD28 antistoffen in oplossing en vervolgens, na TCR gen transfer, kortdurend worden gekweekt met een combinatie van IL-15 en Il-21 voorafgaand aan infusie terug in de patiënt. De patiënten zouden in een dergelijke klinische studie een voorbehandeling moeten doorlopen met een zogenaamd niet-myeloablatief schema zodat de therapeutische T cellen in de patiënten beter overleven. Het vervolgen van behandelde patiënten op lange termijn is essentieel, zowel wat betreft antitumour effectiviteit als veiligheid. Ik heb er vertrouwen in dat een dergelijke klinische studie het volle potentieel van antitumour TCR gen therapie zal aantonen.