Erasmus MC : Marieke de Graaf

5 oktober 2011
Promotor: Prof.dr. P.A.E. Sillevis Smitt
Co-promotor: Dr. J.W. Gratama

SAMENVATTING
Paraneoplastische neurologische syndromen (PNS) zijn bij-effecten van kanker die per definitie niet direct veroorzaakt worden door ingroei van de tumor zelf of door metastasen, noch door infectieuze, vasculaire, metabole of met de behandeling samenhangende oorzaken. De klinische benadering van PNS wordt besproken in Hoofdstuk 2. De meest voorkomende tumor bij PNS is kleincellig longcarcinoom (KCLC). Bij ongeveer 50% van de patiënten met PNS en KCLC kunnen Hu antistoffen worden aangetoond. Dit proefschrift richt zich op PNS geassocieerd met Hu antistoffen (Hu-PNS).
Door aberrante expressie van neuronale eiwitten in de tumor, zogenaamde onconeuronale antigenen, wordt in PNS een immuunrespons uitgelokt die niet alleen gericht is tegen de tumor, maar ook tegen neuronale eiwitten in het zenuwstelsel. Deze immuunrespons resulteert in een betere tumor gerelateerde prognose, maar naast dit gunstige effect veroorzaakt PNS ook ernstige neurologische syndromen waarbij patiënten binnen enkele maanden zeer geïnvalideerd kunnen raken. De pathogene rol van de Hu antistoffen wordt ondersteund door de sterke correlatie van hoge titers Hu antistoffen in serum en liquor met de ontwikkeling van PNS, de intrathecale synthese van Hu antistoffen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en de expressie van Hu antigenen die beperkt is tot het zenuwstelsel en de tumor. Een direct pathogene rol voor Hu antistoffen in de pathogenese van Hu-PNS kon echter nooit bevestigd worden. Daarnaast wordt een rol voor de cellulaire immuniteit in de pathogenese van Hu-PNS verondersteld. Autopsie studies in Hu-PNS patiënten tonen uitgebreide inflammatoire infiltraten met CD4+ en CD8+ T lymfocyten, B lymfocyten en plasma cellen in aangedaan zenuwweefsel. Tevens zijn oligoclonale en monoclonale cytotoxische T-lymfocyten aangetoond in zenuw- en tumorweefsel en bij 78% van de Hu- PNS patiënten ook in bloed.
Het doel van de in dit proefschrift beschreven studies was meer inzicht te krijgen in de mogelijke rol van T cellen in de pathogenese van Hu-PNS door onderzoek van liquor en bloed van Hu-PNS patiënten met verschillende immunologische technieken, zoals flow cytometrie, enzyme-linked immunosorbent spot-forming assays (ELISPOT) en een HLAassociatie studie.

Allereerst hebben we liquor onderzocht met behulp van flow cytometrie. In Hoofdstuk 3 wordt het gebruik van flow cytometrie in liquor beschreven. Flow cytometrie in liquor wordt voornamelijk gebruikt bij patiënten die verdacht worden van leptomeningeale lokalisatie van hematologische maligniteiten. Daarnaast wordt liquor flow cytometrie gebruikt voor onderzoek naar de immuunpathogenese van verschillende neuroinflammatoire aandoeningen zoals PNS. Met deze techniek is het mogelijk om een groot aantal kenmerken van één enkele cel tegelijkertijd te bepalen. Daarnaast kunnen absolute cel aantallen bepaald worden en zeldzame cellen gedetecteerd worden met een hoge sensitiviteit en specificiteit. Flow cytometrie in liquor is echter een uitdagende techniek door het lage cel aantal met een snel dalende viabiliteit. Om de cel viabiliteit in liquor te verbeteren en daarmee de nauwkeurigheid van liquor immuunfenotypering en celtelling te vergroten, hebben we het effect van toevoeging van serumhoudend medium direct na liquor afname onderzocht in Hoofdstuk 4. Toevoeging van serumhoudend medium voorkomt directe celdood in liquor en maakt het mogelijk liquor cellen langer te bewaren totdat flow cytometrische of microscopische analyse plaatsvindt. Zonder toevoeging van medium kan directe celdood resulteren in onderschatting van het aantal cellen in liquor en hiermee wordt de sensitiviteit van flow cytometrie in de diagnostiek van leptomeningeale lokalisatie van hematologische maligniteiten lager.
Om liquor flow cytometrie te kunnen gebruiken voor diagnostiek en research doeleinden in neuro-inflammatoire aandoeningen zoals PNS, zijn referentiewaarden van leukocyten subsets in liquor nodig. Hoofdstuk 5 beschrijft de absolute aantallen en percentages van leukocyten en lymfocyten subsets bepaald met 6-kleuren flow cytometrie in 84 liquor monsters van personen zonder neurologische aandoening. Deze studie laat zien dat normale liquor voornamelijk T lymfocyten met een central memory fenotype bevat, terwijl B lymfocyten zeer schaars zijn. Ook dendritische cellen, zowel myeloïde als plasmacytoïde, zijn aanwezig in liquor. Deze bevindingen suggereren dat onder fysiologische omstandigheden het adaptieve immuunsysteem actief is in liquor, klaar om direct te reageren op binnenkomende, potentieel gevaarlijke, antigenen.
In Hoofdstuk 6 wordt de liquor pleiocytose die meestal voorkomt in Hu-PNS geanalyseerd door de liquor lymfocyten subsets in 12 Hu-PNS patiënten te vergelijken met 15 kankerpatiënten en 27 controles zonder kanker. Dit geeft meer inzicht in de immuunpathogenese van Hu-PNS. Verschillende verschuivingen binnen de liquor lymfocyten subsets in Hu-PNS waren zichtbaar, zoals een 20x hoger aantal B lymfocyten, een 4x hoger aantal T lymfocyten en een lager aantal NKT lymfocyten. Dit wijst op een rol voor B lymfocyten in de intrathecale Hu-antistof productie en antigeen presentatie. Tevens wordt de betrokkenheid van T lymfocyten bevestigd, terwijl het tekort aan NKT cellen de autoimmuun hypothese in Hu-PNS ondersteunt.
De T lymfocytose in liquor suggereert een rol voor T lymfocyten in de pathogenese van Hu-PNS. Daarnaast zijn de T lymfocyten in liquor mogelijk een afspiegeling van de T lymfocyt respons die plaats vindt in het CZS parenchym. In Hoofdstuk 7 hebben we daarom gekeken naar de aanwezigheid van HuD-specifieke T lymfocyten in liquor van 13 Hu-PNS patiënten. Na prospectieve verzameling van liquor, werden T lymfocyten uit liquor aspecifiek geëxpandeerd en getest op reactiviteit met HuD peptiden in IFN-g ELISPOT assays. Tevens werden zowel verse als geëxpandeerde T lymfocyten uit liquor getest op binding met HuD-specifieke HLA klasse I multimeren. Hoewel bij 12 van de 13 Hu-PNS patiënten inflammatoire veranderingen in de liquor gezien werden, konden er geen HuD-specifieke CD8+ T lymfocyten aangetoond worden. Deze bevinding trekt de veronderstelde rol van HuD-specifieke T lymfocyten in de immuunpathologie van Hu-PNS in twijfel, hoewel onze resultaten ook vals-negatief kunnen zijn.

Naast liquor hebben we ook bloed onderzocht. Door te bepalen of humaan leukocyten antigeen (HLA) associatie een rol speelt in Hu-PNS, werd de rol van T lymfocyten in de pathogenese van Hu-PNS verder bestudeerd. Daarnaast zochten we naar een verklaring voor de lage incidentie van Hu-PNS. In Hoofdstuk 8 worden de HLA typeringen van 55 Hu-PNS patiënten vergeleken met 24 KCLC patiënten en 2440 gezonde bloedbank donoren, allen Kaukasisch. De significant hogere frequenties van HLA-DQ2 en HLA-DR3 in de Hu-PNS patiënten suggereert dat HLA-DQ2+ en HLA-DR3+ KCLC patiënten een hogere predispositie hebben voor het ontwikkelen van Hu-PNS. Bovendien wijst dit op een rol voor CD4+ T lymfocyten in Hu-PNS. Kennis van het betrokken auto-antigeen (HuD) in combinatie met specifieke ziekte-geassocieerde HLA klasse II allelen (DQ2 and DR3), kan leiden tot detectie van HuD-specifieke CD4+ T lymfocyten in HLA-DR3+/DQ2+ Hu-PNS patiënten en vervolgens identificatie van het betrokken epitoop. De lage incidentie van Hu-PNS ondanks expressie van het HuD-antigeen in alle KCLC kon echter niet verklaard worden met de resultaten van deze studie.
Tijdens onze eerdere zoektocht naar HuD-specifieke T lymfocyten in bloed, stuitten we in een stimulatie assay met HuD protein-spanning peptide pools (PSPP) op vals-positieve CD8+ T-lymfocyt reacties. Deze vals-positieve reacties worden geanalyseerd in Hoofdstuk 9. Onze data laten zien dat synthetische PSPP immunogene vervuilingen kunnen bevatten die vals-positieve reacties kunnen veroorzaken in T-lymfocyt assays. Daarom adviseren we kritische beoordeling van relevante T-lymfocyt reacties na PSPP stimulatie door bevestiging van deze reacties met behulp van nieuw gesynthetiseerde peptides, bij voorkeur met een zuiverheid van 95% of meer.

Hoofdstuk 10 beschrijft de behandeling van Hu-PNS patiënten met humaan choriongonadotrofine (hCG). In deze prospectieve, niet-gecontroleerde, niet-geblindeerde trial werden 15 Hu-PNS patiënten behandeld met dagelijks 10.000 IU hCG intramusculair gedurende 12 weken. Zeven van de 15 patiënten (47%) toonden verbetering of stabilisatie op de modified Rankin Scale (mRS). Vier patiënten (27%) toonden significante neurologische verbetering in de Edinburgh Functional Impairment Tests (EFIT) en 5 patiënten (33%) verbeterden op de Barthel Index (BI). Deze resultaten wijzen op een immuunmodulerend effect van hCG waarmee mogelijk het beloop van Hu-PNS beïnvloed kan worden, hoewel andere factoren mogelijk ook een rol hebben gespeeld in deze niet-gecontroleerde trial. Daarnaast ondersteunen de resultaten van deze trial de rol van T lymfocyten in Hu-PNS, aangezien hCG inhibitie van Th1 lymfocyten induceert.

Dit proefschrift bevestigt de rol van T lymfocyten in de pathogenese van Hu-PNS door (i) 4x hogere aantallen T lymfocyten in liquor van Hu-PNS patiënten vergeleken met controles; (ii) associatie van Hu-PNS met HLA-DQ2 en HLA-DR3; en (iii) neurologische verbetering of stabilisatie na behandeling met hCG. De aanwezigheid van HuD-specifieke CD8+ T cellen in liquor kon echter niet aangetoond worden. In Hoofdstuk 11 wordt de aanzet geleverd tot toekomstig onderzoek gericht op de voortdurende zoektocht naar HuD-specifieke T lymfocyten in Hu-PNS, aangezien verder onderzoek noodzakelijk is om de rol van T cellen in de pathogenese van deze syndromen op te helderen.